Tema del artículo: Epigenética de la Enfermedad de Alzheimer.

Mecanismo epigenómico tratado:

• Metilación del ADN: La hipermetilación en promotores de genes como BNDF puede reducir la expresión de genes protectores, afectando la plasticidad sináptica, memoria y supervivencia neuronal. La hipometilación en promotores de genes como APP, BACE1 y PSEN1 puede incrementar la producción β-amiloide contribuyendo a la formación de placas amiloides.

• Modificación de histonas: En la acetilación de histonas H3K27 en muestras cerebrales postmortem de EA se identificaron picos acetilados que se localizaron en genes implicados en la patología de la EA (APP, PSEN1, PSEN2 y MAPT. Alternancias en la metilación de histonas, se encontró un aumento de la trimetilación de la lisina en la histona H3 (H3K9, un marcador de silenciamiento génico y condensación de la estructura de la heterocromatina en el cerebro postmortem de sujetos con EA.

• ncRNA (ARN no codificantes): Se incluyen miARNs y IncARNs. Algunos miARNs regulan la expresión de genes implicados en la formación y acumulación de placas amiloides. Por ejemplo: miR-29 y miR-25 están involucrados en la regulación de BACE1 y APP. Por otra parte, miR-146a afecta la regulación de la proteína tau, implicada en la formación de ovillos neurofibrilares. BACE1-AS es un IncARN que regula la expresión de BACE1, impactando la producción de  β-amiloide.

Cómo se lo hizo:

• Inhibidores de las histonas desacetilasas (HDACi): Incluye, vorinostat (SAHA), tricostatina A (TSA), ácido valproico (VPA), 4-PBA y ácido suberoilanilida hidroxámico. El VPA en un modelo de ratón de EA inhibe la producción de péptido beta amiloide in vitro e in vivo, y reduce el nivel de ARNm de NF-κB.
• Tecnologías CRISPR/Cas9 para editar epigenéticamente el ADN:

           - dCas9 fusionado a DNMTs para inducir metilación específica.

           - dCas9 fusinado a TET1 para desmetilar CpGs..

           - dCas9 para dirigir ncRNAs a regiones específicas del genoma.

Resultados: 

• Los inhibidores de HDAC han mostrado resultados prometedores en modelos animales, mejorando la memoria y reduciendo la acumulación de placas de beta-amiloide.
• La modulación de la metilación del ADN ha demostrado ser eficaz en la reactivación de genes silenciados que son cruciales para la función cognitiva.
• La intervención en el ncRNA ha llevado a la regulación de rutas neurodegenerativas, sugiriendo que estos enfoques epigenéticos pueden complementar las terapias existentes y ofrecer nuevas oportunidades para tratar la EA.

Bibliografía:

1.	Nikolac Perkovic M, Videtic Paska A, Konjevod M, Kouter K, Svob Strac D, Nedic Erjavec G, et al. Epigenetics of Alzheimer’s disease. Biomolecules [Internet]. 2021 [citado el 1 de septiembre de 2024];11(2):195. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3390/biom11020195

Técnicas de Edición de Acidos Nucleicos en la Amaurosis Congénita de Leber

 Revisión sobre terapia génica aprobada y recuperación visual en la amaurosis congénita de Leber por mutación en el gen RPE65

Tipo de Edición:

In vivo, somática.

• Dirigido hacia:

Se dirige al gen RPE65, que es crucial para el ciclo visual y la regeneración del 11-cis-retinol. La ausencia de este gen provoca una disminución en los niveles de 11-cis-retinol y acumulación de compuestos dañinos.

• Dirigido por:

Se usan vectores virales adeno-asociados específicamente el serotipo 2 (AAV2) para la entrega del gen corregido RPE65

Se utiliza en sistema CRISPR-Cas9 con ARN guía (sgRNA) diseñado específicamente para dirigirse a las mutaciones en el gen RPE65. Este enfoque permite la corrección directa de las variantes patogénicas en el ADN de las células fotorreceptoras, restaurando la producción de la proteína RPE65 y mejorando la función visual en pacientes con pérdida de visión asociada a estas mutaciones.

• Órgano a tratar:

La retina, específicamente el epitelio pigmentario de la retina y las células fotorreceptoras.

• Vía de administración:

Inyección subretinal, dosis única de voretigene neparvovec en cada ojo (1.5x10^11 genomas vectoriales por ojo en un volumen total de 0.3 ml) administrados con un intervalo no menor de 6 días.

• Resultados:

1. A corto plazo: Se observaron mejoras clínicas y estadísticamente significativas en la capacidad de desplazarse a niveles de luz más bajos, es decir mejoras en la sensibilidad a la luz y en las pruebas de respuesta visual, lo que indica que los fotorreceptores están comenzando a funcionar mejor tras la administración del tratamiento.
2. A mediano plazo: Los efectos clínicos observados a corto plazo se mantuvieron, con mejoras continuas en la capacidad visual y la movilidad en condiciones de baja iluminación. Se continuaron evaluando los datos de seguimiento para determinar la durabilidad de los efectos de la terapia.
3. A largo plazo: Los efectos de la terapia se mantuvieron hasta 4 años después de la inyección, con la expectativa de que se seguirán evaluando los resultados a lo largo de un seguimiento total de 15 años. El objetivo es restaurar permanentemente la visión, con la expectativa de que la expresión del gen RPE65 se mantenga a largo plazo, lo que podría prevenir la progresión de la enfermedad y mejorar la calidad de vida de los pacientes.

Bibliografía:

1. Ciccioli M, Antacle A. Revisión sobre terapia génica aprobada y recuperación visual en la amaurosis congénita de Leber por mutación en el gen RPE65. Oftalmol clín exp [Internet]. 2024 [citado el 25 de agosto de 2024]; 17(01). Disponible en: https://revistaoce.com/index.php/revista/article/view/284

 

Terapia regenerativa o terapia celular o terapia con Stem Cells

Terapia con células madre mesenquimales: una revisión de los ensayos clínicos para la esclerosis múltiple

Tipo de stem cells:

• Células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC)
• Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (AD-MSC)
• Células madre mesenquimales extraídas de cordón umbilical (UC-MSC)

Método de obtención:

• BM-MSC: Se extrae de tejido de médula ósea (mediante aspiración) de la pelvis o el esternón, utilizando una aguja bajo anestesia. La médula extraída se procesa para aislar las células madre mesenquimales.
• AD-MSC: Se obtuvo mediante el método de liposucción de tejido adiposo abdominal y del área de la cadera. El tejido adiposo obtenido se procesa mediante digestión enzimática para liberar las MSC.
• UC-MSC: Se obtienen de tejido de cordón umbilical (gelatina de Wharton). Se procesa para extraer las MSC, se aíslan y expanden mediante técnicas de cultivo celular para su uso clínico.

Vía de administración

Tanto BM-MSC, AD-MSC Y UC-MSC se administraron por vía intravenosa, las células madre se inyectan directamente en el torrente sanguíneo a través de una vena.

·       US-MSC se administró durante 7 visitas (20 x 10⁶ UC-MSC/día).

Resultados 

• Corto plazo:

El tratamiento con MSC ha demostrado ser segura, sin efectos adversos significativos reportado. Se observan mejoras en los síntomas clínicos y en la puntuación de discapacidad en los primeros meses tras la infusión.

• Mediano plazo:

Cambios en la respuesta inmunológica a los 12 meses después del tratamiento. Mejora de la prueba de función neurológica y de EDSS.

Las resonancias magnéticas del cerebro y la médula espinal cervical mostraron lesiones inactivas en 15 de 18 sujetos después de 1 año.

Disminución de la inflamación y desmielinización en el SNC.

Mejoraron los resultados neuroconductuales y redujeron la infiltración inflamatoria, así como la desmielinización en la médula espinal. 

• Largo plazo:

Aún no está completamente claro, pero puede lograr la estabilidad en la progresión de la discapacidad, con mejoras sostenidas en la puntuación de EDSS, restauración de la función de las células T reguladoras (Tregs), lo que ayuda a controlar la respuesta inmune.

Avances logrados

Se ha comprobado que las UC-MSC son la mejor opción para tratar la EM. Los pacientes tratados con UC-MSC presentan una disminución en la actividad de la enfermedad, evidenciada por la reducción en la cantidad de lesiones visibles en las resonancias magnéticas y en las puntuaciones de la Escala Expandida de Discapacidad. También se ha descubierto que las UC-MSC afectan a la función de las Tregs desactivadas en pacientes con EM in vitro y los revierten a condiciones normales.

Bibliografía:

1. Alanazi A, Alassiri M, Jawdat D, Almalik Y. Terapia con células madre mesenquimales: una revisión de los ensayos clínicos para la esclerosis múltiple. Regen Ther [Internet]. 2022; 21:201–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.reth.2022.07.003

Animal transgénico para uso en medicina

• Tipo de animal transgénico:

Cerdo transgénico (knock-in) que expresa un gen mutado de la rodopsina (Pro347Leu [P337L]). (1)

• Métodos de obtención:

Se obtuvo mediante microinyección pronuclear, consiste en:

1. Construir un vector de sustitución con el gen mutado de la rodopsina, bajo un promotor específio.
2. Recolectar cigotos fertilizados del animal de interés (cerdo).
3. Con un micromanipulador se inyecta el ADN del vector en el pronúcleo masculino del cigoto. Este nuevo material genético se inserta en el genoma del cerdo por recombinación homóloga.
4. Este cigoto se implanta en una cerda receptora para que continúe su desarrollo y al final de la gestación obtener cerdos transgénicos.
5. Se realiza técnicas genéticas (como: PCR, Southern blotting) en los lechones para confirmar la incorporación del transgén en su genoma. (1)

• Para que fue utilizado:

El cerdo transgénico en este caso se usó para estudiar la evolución de la retinitis pigmentosa (RP), ya que este modelo animal desarrolla una degeneración de la retina la cual morfológica y electrofisiológicamente semeja la que se presenta en humanos con RP. En estos cerdos, a las 2 semanas de nacidos se observó la muerte de algunos bastoncillos y a los nueve meses todos los bastoncillos están degenerados. También han sido utilizados para valuar tratamientos como trasplante de la retina de cerdos normales a cerdos P347L transgénicos. (1)

Es importante mencionar que los cerdos transgénicos también se han usado para estudiar la evolución de otras enfermedades como: fibrosis quística, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, entre otras. (1)

Ventajas y desventajas de los transgénicos

5 Ventajas

1. Los animales transgénicos se usan como modelos para estudiar la evolución de enfermedades humanas. ( Endermedad de Alzheimer, fibrosis quística, etc).
2. Producción de grandes cantidades de proteínas como la insulina para tratar la diabetes.
3. Los cultivos transgénicos pueden resistir condiciones extremas (sequías, heladas o plagas) lo que garantiza un mayor rendimiento en situaciones adversas.
4. Conservación de especies en peligro de extinción mediante la introducción de genes que mejoren la resistencia a enfermedades y la adaptabilidad a cambios ambientales.
5. Producción eficiente de vacunas y anticuerpos monoclonales a través de animales transgénicos. (2, 3,4)

5 Desventajas

1. Pueden generar una resistencia a los antibióticos de gérmenes que infecta al ser humano, con sus graves consecuencias sobre la salud, o de gérmenes que afectan la producción ganadera o avícola.
2. Los organismos transgénicos (OT) pueden generar reacciones alérgicas en los consumidores, por lo cual es importante un etiquetado de los productos que contienen algún porcentaje de OT.
3. Pérdida de fármacos de origen vegetal (fitofármacos) o de hongos (antibióticos) como consecuencia de pérdida de la biodiversidad o de la contaminación con genes transgénicos.
4. Los animales transgénicos podrían cruzarse con poblaciones silvestres y dañar la biodiversidad.
5. Cultivos resistentes a herbicidas puede conducir al desarrollo de supermalezas más resistentes, lo que a su vez puede aumentar el uso de herbicidas más potentes y tóxicos, perjudicando la salud de seres humanos. (2, 3, 4)

Bibliografía:

1. Estrada López JL. El cerdo transgénico: curiosidad o realidad médica?. Academia Colombiana de Ciencias Veterinarias. [Internet]. 2010 [citado el 27 de julio de 2024] Disponible en: https://academiacolombianadecienciasveterinarias.org/wp-content/uploads/2023/10/v2r1112010.pdf#page=40
2. Tchernitchin AN. Organismos Transgénicos: Ventajas y Riesgos. Unirioja.es [Internet]. 2010 [citado el 27 de julio de 2024] Disponible en: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=9510728
3. Spendeler L. ORGANISMOS MODIFICADOS GEN... TICAMENTE: UNA NUEVA AMENAZA PARA LA SEGURIDAD ALIMENTARIA [Internet]. Scielosp.org. 2005 [citado el 28 de julio de 2024]. Disponible en: https://www.scielosp.org/pdf/resp/2005.v79n2/271-282/es
4. Oviedo M. Ventajas y Desventajas de los Alimentos Transgénicos [Internet]. La Guía de las Vitaminas. 2015 [citado el 28 de julio de 2024]. Disponible en: https://laguiadelasvitaminas.com/ventajas-y-desventajas-de-los-alimentos-transgenicos/

ADN recombinante artificial o quimérico o clonación de genes

• Tema: Clonación y expresión recombinante de los dominios variables tipo-Inmunoglobulina de los inmunorreceptores PD-1 y PD-L1 humanos.
• Objetivo: Clonar y expresar los dominios variables IgV de PD-1 y PD-L1 en E. coli para producir proteínas recombinantes, facilitando el desarrollo de anticuerpos monoclonales para la inmunoterapia contra el cáncer.
• Gen o secuencia clonar: Regiones codificantes de los dominios extracelulares IgV de PD-1 y PD-L1.
• Enzima de restricción: BamHl y Hbal.
• Enzima ligasa: T4 ligasa.
• Vector: pcDNA6
• Célula receptora: Procariota: Escherichia coli.
• Mecanismo de transferencia o inserción del gen: Transformación bacteriana por choque térmico, se llevó a cabo un protocolo destinado a preparar bacterias competentes de la cepa Escherichia coli BL21-(DE3)
• Métodos de identificación de clones: Se cultivó la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (ATCC HTB-22) en medio RPMI-10, suplementado previamente con 10% de suero fetal bovino, descomplementado previamente a 56 °C, 50 uM de 2-mercaptoetanol y 50 ug/mL de gentamicina empleando botellas de plástico con cuello angular y tapa ventilada estériles de 25 cm2. Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 37 °C en una incubadora, con atmósfera húmeda y 5% de CO2. Las regiones génicas de interés de Pdcd1 y de Pdl1 fueron clonadas mediante PCR y los productos obtenidos fueron evidentes mediante electroforesis en geles de agarosa.  Resultados: Productos PD-1 (375 pb) y PD-L1 (357 pb), permitirán la producción de un MAb u otra herramienta inmunoterapéutica contra el cáncer (1).
  
  
         Figura 1: Clonación y secuenciación de los IgV de PD-1 y PD-L1

Ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza

Rhizobium leguminosarum forma una simbiosis con plantas leguminosas, como frijoles y guisantes. La bacteria detecta señales químicas de las raíces y se introduce en las células del tejido radicular, formando nódulos. En estos nódulos, R. leguminosarum transfiere fragmentos de su ADN a las células vegetales, permitiendo a la planta fijar nitrógeno atmosférico. La planta proporciona azúcares a la bacteria, mientras que R. leguminosarum ofrece nitrógeno esencial a la planta. Este intercambio beneficia a ambos y también ayuda a mejorar la fertilidad del suelo de manera natural (2).

Bibliografía:

1. González P, López EB, Moreno HSL. Clonación y expresión recombinante de los dominios variables tipo-Inmunoglobulina de los inmunorreceptores PD-1 y PD-L1 humanos. QUIBIOUAS [Internet]. 2024 [citado el 20 de julio de 2024]; (2):1–10. Disponible en: https://revistas.uas.edu.mx/index.php/QBU/article/view/598
2. Jiménez Nieto N. Simbiosis entre Rhizobium y leguminosas para la mejora de la calidad del suelo frente a situaciones adversas. Universitat Politècnica de València [Internet]. 2022 [citado el 20 de julio de 2024] Disponible en: https://riunet.upv.es/handle/10251/184909

 Técnicas de secuenciación en el síndrome de Tourette (ST)

Se han realizado escasos estudios de secuenciación masiva del genoma en pacientes con ST, en los cuales se han descubierto nuevas variantes genéticas posiblemente causantes de la enfermedad en varios genes como MRPL3, DNAJC13 y OFCC1.  Por otra parte, Willsey y colaboradores realizaron secuenciación completa del exoma (WES) en dos cohortes de pacientes con ST y encontraron variantes de novo potencialmente patógenas en aproximadamente 400 genes, lo que podría explicar el riesgo genético en el 12% de los casos de ST. Además, se identificaron cuatro genes con probabilidad más alta de ser patógenos: WWC1, CELSR3, NIPBL y Fibronectina 1.

Bibliografía: 

1. Pagonabarraga Mora J, Ruiz Barrios I. Estudios genéticos en el síndrome de Tourette. Sen.es. [Internet]. 2023 [citado el 22 de junio de 2024]. Disponible en: https://www.sen.es/pdf/2023/Manual_Genetica_TM.pdf#page=151

 Técnica de PCR para diagnosticar COVID-19

El COVID-19 es una enfermedad infecciosa causada por el coronavirus SARS-CoV-2. La técnica de PCR es una prueba de laboratorio más precisa que se usa para diagnosticar una infección por el virus SARS-CoV-2. Los hisopados nasofaríngeos y orofaríngeos son las muestras típicamente usadas para confirmar la presencia del virus mediante RT-PCR. Esta técnica ayuda a extraer el material genético del virus que en este caso es el ARN y también permite amplificarlo, lo que lo hace detectable.

Tema: Factores relevantes sobre el ensayo RT-PCR para la detección de SARS-CoV-2, virus causante del COVID-19.

Objetivo: Identificar la presencia del ARN viral del SARS-CoV-2 en muestras respiratorias, mediante la técnica de RT-PCR, la cual permite un diagnóstico temprano y preciso de la infección.

Tipo de muestra biológica: Hisopados nasofaríngeos y orofaríngeos.

Tipo de ácido nucleico a ser extraído: ARN viral del SARS-CoV-2, mediante dos métodos principales: 1. Extraer usando cromatografía por columna que se basa en la adsorción reversible del ácido nucleico a una membrana de sílice bajo condiciones específicas de pH y fuerza iónica. 2. El uso de partículas magnéticas la cual implica la unión rápida y reversible del ácido nucleico, seguido de su separación mediante un campo magnético externo, logrando su aislamiento y purificación.

Gen o secuencia a amplificar: Amplificación de los siguientes genes: ORF1b (12652 pb), ORF1ab (21291 pb), N (1260 pb), RdRP (1253 pb), E (228-231 pb), RP (8200 pb) y S (3822 pb).

Tipo de PCR: RT-PCR

Visualización: Para la extracción del ARN viral se empleó el kit EZ1® DSP Virus Kit and Buffer AVL. El ensayo RT-PCR es una herramienta poderosa que permite identificar, detectar y cuantificar ARN en muestras biológicas, utilizando este como molde para sintetizar ADNc, el cual luego sirve como plantilla para una reacción de PCR en tiempo real. El aumento exponencial del ADN se mide a través de la fluorescencia, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de ARN presente en la muestra. Esto hace que la técnica sea muy sensible, incluso cuando hay bajas concentraciones de ácidos nucleicos virales.

   Imagen obtenida de: https://www.revista.unam.mx/wp-content/uploads/RDU_2021.22.5.8_Figura4.jpg

Bibliografía:

1. Vásquez Rodriguez EA, Guadrón Meléndez AA, Cruz Aguilar RDJ, Cuadra ZelayaTE. Factores relevantes sobre el ensayo RT-PCR para la detección de SARS-CoV-2, virus causante del COVID-19. Alerta [Internet]. 2021;4(1):31–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.5377/alerta.v4i1.10060